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I virus

12/04/2018

I virus sono parassiti intracellulari obbligati costituiti da materiale genetico racchiuso in un involucro proteico (o proteico e lipidico) che non permette loro alcuna funzione biologica autonoma quali la produzione di energia, la sintesi di proteine e la replicazione. Sono presenti nel mondo animale e vegetale.

Un po' di storia

In quanto entità molto piccole (due, tre ordini di grandezza in meno rispetto ai batteri) che non possono essere visualizzate al microscopio ottico la loro scoperta avviene in modo induttivo solo verso la fine dell’800. Nel 1892 Ivanowsky, un botanico russo, dimostrò che estratti dalle foglie di tabacco ammalate, passate attraverso filtri capaci di trattenere i batteri risultavano ancora infettive. Qualche anno dopo, Beijerinck osservò che il filtrato diluito poteva acquisire “forza” se rimesso a contatto con le piante: da qui nacque l’idea che si trattasse di un’entità replicante piuttosto che di un agente chimico o una tossina (che al contrario avrebbe perso forza dalla diluizione) e coniò il termine “virus” (dal latino per veleno) per denotare questi “agenti filtrabili”. Dovevano passare ancora una quarantina d’anni prima che H. Ruska ottenga le prime immagini del virus mosaico del tabacco al microscopio elettronico. Nel frattempo si scopre l’origine virale di molte malattie dell’uomo come degli animali (febbre gialla, poliomielite, afta epizootica, ecc.), il potenziale oncogeno di alcuni virus (Rous, 1911) e si individuano i batteriofagi che permettono di studiare i virus in modo più semplice e veloce. Le conoscenze e tecniche sviluppate sui batteriofagi, dagli anni ’50, vengono ulteriormente approfondite grazie all'utilizzo delle colture cellulari che permettono l’isolamento di molti virus patogeni per l’uomo e gli animali; un ulteriore impulso si avrà con le tecniche di analisi molecolari quali la PCR sviluppate negli anni ’70-’80 e le tecniche di sequenziamento del genoma.

Morfologia e caratteristiche peculiari dei virus

I virus presentano una serie di caratteristiche che li differenziano in modo radicale dai batteri come da tutte le altre forme viventi: in sintesi:

  • I virus sono parassiti intracellulari obbligati: possono resistere nell’ambiente per un periodo più o meno lungo ma non possono riprodursi se non infettando le cellule di un organismo animale o vegetale;
  • Hanno un modo di riprodursi totalmente diverso da quello utilizzato dalle cellule procariote ed eucariote: mentre queste si riproducono per fissione binaria, mitosi e meiosi i virus penetrano la cellula, si liberano di capside/pericapside e rilasciano il materiale genetico nel citoplasma o nel nucleo; qui utilizzano i meccanismi e gli enzimi cellulari per sintetizzare copie del proprio genoma e le proteine strutturali che in un secondo momento verranno assemblate per formare i nuovi virioni che usciranno dalla cellula;
  • A differenza dei batteri hanno un corredo genetico composto solo da DNA o solo da RNA in varie forme (monocatenario, bicatenario, a senso positivo o negativo);
  • Produzione di energia: i virus non dispongono di molecole ATP e quindi non sono in grado di produrre energia e di gestire processi metabolici;
  • Non hanno ribosomi e quindi non possono sintetizzare proteine in modo autonomo;
  • Sensibilità agli antibiotici: i virus non sono sensibili agli antibiotici ma lo sono agli interferoni.
Il virione, cioè la particella virale, è costituito da materiale genetico racchiuso in una capsula proteica (naked o non-enveloped viruses) oppure ricoperto una ulteriore strato di materiale lipidico (enveloped viruses). Capside e pericapside svolgono una doppia funzione di protezione del materiale genetico nella fase extracellulare del virus (quando transita da una cellula all’altra e da un ospite all’altro) e di adesione alla cellula ospite.
Questa caratteristica morfologica ha una importante implicazione pratica in quanto i virus non-enveloped vengono inattivati solo da solventi inorganici mentre contro i virus enveloped possono essere utilizzati i solventi organici.

Tecniche quali la cristallografia a raggi X, la microscopia elettronica e crioelettronica hanno permesso di stabilire con buona approssimazione la morfologia dei virus.
Tutti i virus hanno un capside che racchiude il materiale genetico (ed eventuali proteine funzionali ) con la doppia funzione di protezione ed adesione alle cellule target. Il capside è costituito da subunità proteiche ripetute organizzate in modo simmetrico in una forma ad icosaedro o elicoidale o variamente complessa. I virus enveloped hanno poi un’ulteriore rivestimento costituito da lipidi e carboidrati di derivazione cellulare oltre a delle caratteristiche “protuberanze” (spikes in inglese) che intervengono nella fase di adesione.

Virus non enveloped (naked) e virus enveloped

I virus si distinguono inoltre per la tipologia del materiale genetico che contengono: solo DNA o solo RNA, mono e bicatenario, a polarità positiva o negativa (sense e antisense): caratteristiche determinanti per le modalità di riproduzione.

Abbiamo fin qui accennato ad alcune caratteristiche distintive dei virus: la presenza o meno di un envelope, la morfologia, la diversità del loro materiale genetico. A queste caratteristiche se ne possono aggiungere altre quali la malattia di cui sono responsabili, se colpiscono piante o animali o se portate da vettori. Questa varietà di caratteristiche e l’indisponibilità delle moderne tecniche genetiche ha dato storicamente luogo ad una certa confusione per quanto attiene alla tassonomia e alla nomenclatura. Alcune specie hanno preso il nome dalla malattia che provocavano (poliovirus, foot-and-mouth disease virus - afta epizootica, ecc.), dal luogo di origine (West Nile Virus), dallo scopritore (Epstein-Barr Virus), ecc.

Classificazione di Baltimore (tratto dall'articolo originale)

Un altro criterio di classificazione è quello di Baltimore(1), risalente all’inizio degli anni ’70, che propose una iniziale suddivisione dei virus in 6 classi (se ne è poi aggiunta una settima) sulla base delle caratteristiche del loro materiale genetico, ponendo l’accento sulla centralità della sintesi del mRNA.
Attualmente l’International Committee on Taxonomy of Virus(2) ha classificato i virus in 8 ordini e uno non assegnato, con decine di famiglie e centinaia di specie censite.

Replicazione virale

Come si è accennato, esiste una grande diversità in termini di materiale genetico oltreché di morfologia tra le diverse specie di virus e c’è conseguentemente una grande diversità nel modo in cui i singoli virus si replicano; nonostante ciò ci sono degli elementi comuni nel processo di replicazione che caratterizzano i virus nel loro insieme.

Tutti i virus devono aderire a cellule suscettibili dell’ospite, entrare in esse e liberare il proprio genoma perdendo il capside/pericapside (disassemblaggio) per poi replicare il materiale genetico e sintetizzare le proteine necessarie ed infine ricostruire “de novo” il virione pronto ad uscire dalla cellula. Si tratta di un meccanismo radicalmente diverso tanto dalla semplice scissione binaria utilizzata nei batteri quanto dal più complesso meccanismo di mitosi/meiosi tipico degli organismi multicellulari.

Il modo in cui i virus replicano all’interno della cellula dà origine al cosiddetto “eclipse period” in cui, in una coltura, per un certo periodo di tempo si perdono le tracce del virus (quando entra nella cellula, perde il capside e inizia la replicazione) seguito da una crescita esponenziale delle particelle virali (assemblaggio e rilascio) che dura fino a quando la cellula non va incontro a lisi.

eclipse period


Il ciclo di vita dei virus può essere litico o lisogeno a seconda delle specie. Nel ciclo litico il virus genera un grande numero di copie che evadono dalla cellula causandone la distruzione (lisi) mentre nel ciclo lisogeno si ha una integrazione del materiale genetico virale in quello cellulare (episoma, provirus o profago per quanto riguarda i fagi) per cui l’infezione si trasmette per successive mitosi senza causare la distruzione della cellula: a volte il ciclo lisogeno può diventare litico. Questa modalità è tipica dei retrovirus ma non solo.

Una determinata specie/ceppo di virus è in grado di infettare solo determinate specie ed in particolare specifici tessuti (tropismo virale(3)) in quanto devono sussistere le condizioni perché il virus possa aderire alla cellula per poi penetrarla e riprodursi al suo interno. L’adesione del virus alla cellula (attachment) dipende dalle interazioni che si instaurano tra componenti del capside/pericapside/spikes e molecole di membrana o recettori della cellula (che non sono “recettori virali” ma recettori con proprie funzioni fisiologiche che fungono da recettori virali). Alcuni virus sono in grado di usare diversi recettori presenti in specie diverse mentre altri sono più specifici; alcuni virus usano alcuni recettori quando coltivati in vitro e altri in vivo; in altri casi il virus si può legare ad immunoglobuline non neutralizzanti che a loro volta si legano ai recettori delle cellule fagocitarie (macrofagi), ecc.
Dopo aver aderito alla cellula il virus deve riuscire a penetrare la parete cellulare: ogni tipo di virus mette in atto strategie diverse per penetrare la cellula ma questi si possono ricondurre a due meccanismi fondamentali: la penetrazione diretta attraverso la parete cellulare e la penetrazione sfruttando il meccanismo dell’endocitosi: in entrambi i casi il virione entra nella cellula, si libera del proprio capside e del pericapside (enveloped viruses) e rilascia il materiale genetico nel citoplasma o nel nucleo a seconda del tipo di virus. Nella penetrazione diretta, tipico dei virus non-enveloped, l’interazione con il recettore induce una modificazione del capside virale che porta alla formazione di un poro nella membrana attraverso il quale il genoma fluisce nel citoplasma. L’endocitosi avviene con meccanismi diversi e si realizza con diversi mediatori (clatrina, caveolina) sfruttando l’aumento del pH negli endosomi come stimolo per la fusione del capside virale con la vescicola e la liberazione del materiale genetico.

Dopo che il virione è penetrato nella cellula, si è disassemblato liberando il proprio materiale genetico che rimane nel citoplasma o penetra nel nucleo, ha inizio il processo di replicazione propriamente detto che consiste nella replicazione del genoma, di eventuali enzimi ad esso associati (proteine funzionali) e nella produzione dei componenti del capside (proteine strutturali) necessari per l’assemblaggio dei nuovi virioni. Questo processo avviene con il coinvolgimento di enzimi di origine virale e/o dell’ospite per la duplicazione del genoma e con l’utilizzo dei ribosomi per la produzione delle proteine.
Le strategie di replicazione sono molto diverse da virus a virus in relazione alle caratteristiche del suo genoma (ssDNA, dsDNA, RNA(+), RNA(-), ecc.).

Nelle cellule eucariote e procariote il “contenuto informativo” è mantenuto nel DNA che viene poi letto e trascritto in RNA e a sua volta tradotto in proteine: “transcription” (DNA->RNA) e “translation” (RNA->proteine) sono i due processi fondamentali per la vita cellulare. I virus mantengono il loro “contenuto informativo” nelle forme più diverse e di conseguenza il processo di trascrizione e traduzione non è così lineare come nelle cellule. Ad esempio un RNA(-) non può essere usato per la sintesi di proteine ma deve prima essere convertito in RNA(+); le cellule non posseggono enzimi per duplicare l’RNA e quindi i virus di questo tipo devono sintetizzarle o devono averli “incorporati” nel virione (RNA polimerasi RNA dipendente - RdRp); in alcuni casi il materiale genetico del virus deve entrare nel nucleo per sfruttare gli enzimi nucleari e in altri casi la replicazione avviene interamente nel citosol: in entrambi i casi il processo si realizza nelle cosiddette “viral factories” cioè compartimenti intracellulari che si formano a seguito di una modificazione della struttura della membrana o del citoscheletro che ha la funzione di rendere più efficace il processo replicativo e proteggerlo dai meccanismi di difesa dell’ospite.
Negli articoli relativi alle diverse malattie virali del gatto (che verranno pubblicati successivamente) si accennerà alle strategie replicative delle specie virali coinvolte.

In sintesi: il virione contiene il materiale genetico e, nel caso, gli enzimi indispensabili alla replicazione qualora questi non siano presenti nella cellula (es. retrotrascrittasi). Attraverso passaggi più o meno complessi vengono prodotti altri enzimi funzionali alla replicazione, le proteine strutturali che formeranno i nuovi virioni e verrà duplicato il materiale genetico originario.

Dopo aver creato copie del proprio materiale genetico e sintetizzato le proteine strutturali inizia la fase di assemblaggio e rilascio dei nuovi virioni. Le proteine virali strutturali sono in grado di aggregarsi tra loro a formare i protomeri che a loro volta costituiscono i “mattoncini” del capside: questi si organizzano in forma icosaedrica o in altra forma (elicoidale, ecc.) in modo spontaneo, legandosi al materiale genetico o con l’ausilio di chaperones. Questo processo di maturazione avviene, a seconda della specie di virus nel nucleo o nel citoplasma. Per molti virus non enveloped il rilascio dei virioni avviene con la lisi della cellula (ciclo litico).
Il processo di maturazione ed esocitosi dei virus enveloped avviene per gemmazione: un processo in cui la particella virale acquisisce componenti (glicoproteine, lipidi) dalle strutture cellulari (reticolo endoplasmatico, membrana nucleare e cellulare) per poi indurre un rigonfiamento della membrana ed uscire dalla cellula. Nella maggior parte dei casi i virioni vengono rilasciati in un periodo di tempo lungo senza danneggiare l’integrità della cellula e sono caratteristici di infezione persistente (ciclo lisogeno).

Patogenesi virale

Un’infezione virale non necessariamente significa malattia: molte sono subcliniche, asintomatiche, non rilevate: il virus si adatta all’ospite, si moltiplica e si diffonde ad altri soggetti senza causare malattie; sono relativamente poche le specie che causano una sintomatologia più o meno grave. Il termine patogenicità indica la capacità di un virus di causare malattia mentre il termine virulenza attiene alla capacità del patogeno di superare le difese dell’ospite e ha un significato prevalentemente relativo (il ceppo A è più virulento del ceppo B) anche se esistono dei criteri di misurazione; entrambi questi concetti sono scorrelati dall’ infettività/trasmissibilità del virus.
La resistenza/suscettibilità alle malattie virali è legata a diversi fattori fisiologici quali età (maggiore incidenza in soggetti giovani e molto anziani), gravidanza (es. infezioni latenti da herpervirus che provocano aborti e infezioni perinatali), grado di differenziazione cellulare (es. parvovirus), livelli elevati di corticosteroidi endogeni o esogeni che anch’essi possono riattivare o esacerbare infezioni latenti o subcliniche (es. terapie immunosoppressive o stress causato da rehoming/sovraffollamento in rifugi).
In generale, le vie di ingresso dei virus sono il tratto respiratorio, quello gastrointestinale, la cute (via puntura da artropodi) e il tratto urogenitale dove si ha una prima fase replicativa nei linfonodi periferici; da qui, attraverso il sistema linfatico/torrente circolatorio i virus raggiungono fegato, milza, midollo osseo dove avviene una seconda fase replicativa (viremia secondaria). Infine, moltiplicati, i virioni raggiungono le mucose (intestinali, respiratorie, ecc.) dando luogo all’escrezione attraverso feci, urine, saliva o scolo nasale/congiuntivale a seconda del virus. Non tutti i virus presentano le stesse vie di eliminazione. In alcuni casi i virus si insediano nel cervello/tessuti nervosi non dando luogo ad escrezione (dead end).
I virus patogeni causano danno cellulare/tissutale in modo diretto o mediato dal processo infiammatorio come risposta dell’organismo. Le infezioni virali possono assumere diverse forme. Le infezioni citopatiche sono produttive (generano progenie virale) e tipicamente portano alla morte cellulare per lisi (tipicamente i non enveloped virus). L’infezione citopatica può anche portare alla formazione di corpi inclusi, alla distruzione del citoscheletro, a sincizia, necrosi e apoptosi. Ci sono anche infezioni non citopatiche che causano un’infezione persistente in cui la malattia è causata dalla alterazione di una specifica funzione cellulare (es perdita di conduttività di un neurone) o dalla risposta infiammatoria e sono caratterizzate da un basso o talvolta nullo tasso di replicazione (il soggetto diventa un carrier).
Le infezioni latenti in cui il genoma virale viene integrato in quello cellulare (provirus) o viene mantenuto in forma di episoma è il caso dei retrovirus e di alcuni virus a DNA) si possono considerare una forma di infezioni persistenti in quanto la cellula va incontro a normale duplicazione e non c’è trascrizione dei geni virali (ad eccezione di alcuni necessari per mantenere lo stato di latenza) e quindi non sono produttive in modo continuativo. Tuttavia assumono comunque una valenza patologica in quanto l’espressione dei geni virali viene periodicamente riattivata oppure causano un lento progredire della malattia; in questa categoria rientrano anche le infezioni con virus oncogenici.
Da notare che diversi virus che risultano citocidi in coltura non sono patogenici in vivo (es. molti enterovirus) mentre altri che non sono citocidi in coltura causano di malattie mortali in vivo (es. il virus della rabbia).
Il danno cellulare indotto da un’infezione virale comporta diverse conseguenze in relazione al tessuto coinvolto, alla reazione immunitaria che suscitano, alla possibile coinfezione batterica. A titolo esemplificativo, le infezioni del tratto respiratorio portano alla perdita dell’attività ciliare, a lesioni multifocali dello strato di muco e delle cellule epiteliali che la reazione infiammatoria può aggravare causando difficoltà respiratorie e ipossia. A questo si sommano gli effetti indiretti causati da coinfezioni batteriche come dalla proliferazione della flora batterica normalmente tenuta sotto controllo. Nelle infezioni virali del tratto gastrointestinale si ha distruzione degli enterociti maturi (es coronavirus) o degli enterociti immaturi in rapida divisione (es. parvovirus) e ne consegue diarrea, perdita di liquidi, squilibri elettrolitici, ipoglicemia, ecc.: tutte condizioni patologiche che risultano ben più gravi del danno cellulare direttamente provocato dal virus. Si possono sviluppare analoghe considerazioni sul danno d’organo relativamente alle infezioni del cervello, dei tessuti emopoietici (es. immunosoppressione), vascolari, ecc.
Il danno di un’infezione virale non è sempre conseguenza dell’azione distruttiva che il virus esercita sulle cellule ma ad esempio da immunopatologie anticorpo-mediate: nelle infezioni persistenti si possono verificare danni d’organo (vascolari, glomerulari, ecc.) dovuti dalla deposizione di immunocomplessi.

Immunità antivirale e meccanismi di evasione

L’immunità antivirale è data dall’azione combinata dell’immunità innata e di quella adattativa, sia umorale che cellulo-mediata; qui si accenna solamente al ruolo degli interferoni e ai meccanismi di evasione messi in atto dai virus.

Le proteine virali e l’acido nucleico (DNA/RNA) sono riconosciuti come non-self da diverse classi di PRR (Pattern Recognition Receptor) che attivano la secrezione di numerose molecole di segnalazione (citochine) che regolano la risposta immunitaria.

Una classe di citochine particolarmente importante nell’immunità antivirale è quella degli interferoni. Nel 1957 a Isaac e Lindenmann individuarono queste proteine non virali secrete da cellule d’uovo in coltura infettate dal virus dell’influenza che avevano il potere di preservare le altre dall’infezione. Le successive ricerche hanno individuato diversi tipi di interferoni: gli interferoni di tipo I (principalmente IFN-alfa, beta e omega) che sono prodotti da molti tipi cellulari e giocano un ruolo fondamentale nel limitare la diffusione dell’infezione; gli interferoni di tipo II prodotti dai linfociti T e cellule NK coinvolti nel processo di attivazione di macrofagi, nel richiamo di leucociti nel sito di infezione e nel potenziamento degli IFN di tipo I; infine vi sono altri tipi di interferoni (IFN III) prodotti in specifici tessuti. Gli interferoni una volta secreti si legano a specifici recettori cellulari e attivano una cascata di segnalazione che porta all’espressione di oltre 20 geni. Il meccanismo d’azione di queste citochine è molto complesso e non ancora del tutto chiarito: tra questi ricordiamo quello di degradare l’mRNA e interferire nella sintesi delle proteine (sia quelle virali che quelle cellulari) e causare la morte cellulare (limitando così la diffusione del virus): da qui la potenziale tossicità degli interferoni. Inoltre hanno la capacità di aumentare l’espressione del MHC di classe I e del MHC II nelle APCs favorendo in tal modo l’azione immunitaria. Sono inoltre in grado di stimolare l’azione delle cellule NK che svolgono un ruolo importante nella difesa contro i virus (ed i tumori) oltre ad essere produttori di interferone gamma (IFN di tipo II) che a sua volta stimola altre cellule dell’immunità innata ed adattativa.

Molti virus a RNA tendono ad inibire i normali meccanismi di trascrizione/traduzione impedendo alla cellula la produzione di molecole MHC I e di interferoni; in tal modo, senza una risposta efficace da parte dell’immunità innata, si ha una rapida replicazione e diffusione dell’infezione prima che l’immunità adattativa possa esplicare la sua azione. Inoltre, la mancata espressione del MHC I ottenuta dai virus in modi diversi impedisce una risposta efficace da parte dei linfociti T citotossici che utilizzano il legame con il MCH I per individuare le cellule da distruggere. Inibendo l’espressione del MHC I si favorisce però l’azione delle cellule NK ma in questo caso i alcuni virus agiscono inibendo la produzione di quelle molecole di superficie (heat-shock protein, ecc.) che agiscono come secondo segnale in tal modo l’azione delle NK.
Specie i virus a DNA a lenta replicazione attuano un’altra strategia che consiste nel bloccare i processi apoptotici della cellula garantendo il tal modo la propria sopravvivenza. Altra tecnica utilizzata dai virus è quella di inibire la produzione o impegnare i recettori di importanti citochine quali interferoni e interleuchine, anche qui allo scopo di far sopravvivere la cellula infetta.

Accenno alle principali tecniche diagnostiche

La diagnosi di una malattia virale si ha attraverso la conferma strumentale di una ipotesi diagnostica: in altri termini si verifica che uno specifico virus sia davvero presente in un campione biologico dell’animale. Attraverso varie tecniche si può individuare un virus in modo diretto ricercando l’antigene virale o l’acido nucleico (DNA o RNA), oppure in modo indiretto ricercando la presenza di anticorpi specifici. La presenza di un virus in un campione può anche essere rilevata con la microscopia elettronica e l’isolamento virale che si basa su tecniche di coltura cellulare su cui far crescere i virus e poi identificarli con altre tecniche: in entrambi i casi si tratta di tecniche utilizzate in ambito di ricerca specie quando il virus in oggetto è sconosciuto.
Nella clinica degli animali d’affezione, un test deve essere caratterizzato, oltre che da un buon dato di sensibilità/specificità, dalla semplicità di prelievo e trasporto del campione, dalla disponibilità di laboratori che lo eseguono, dal tempo necessario alla refertazione, e, non ultimo, dal costo. Nel seguito si accenna brevemente alle tecniche più comunemente utilizzate: immunofluorescenza, immunoistochimica, ELISA, PCR, misurazione degli anticorpi.

Immunofluorescenza e immunoistochimica

Entrambe le tecniche si basano sul legame tra antigeni virali e anticorpi ed entrambe le tecniche si possono applicare a campioni citologici e istologici. Nell’immunofluorescenza diretta si utilizzano anticorpi marcati con un fluorocromo che legano l’antigene e vengono visualizzati con un microscopio ottico a fluorescenza; in quella indiretta si usa un anticorpo per legare l’antigene e un anti-anticorpo marcato che lega l’anticorpo. L’immunoistochimica si basa anch’essa sulla coniugazione tra antigene ed anticorpo ma il sistema di rilevazione, il cambio di colore del preparato, avviene su base chimica tramite enzimi e non attraverso fluorocromi. A differenza dell’immunofluorescenza si usano campioni fissati in formalina e non freschi e la refertazione richiede tempi più lunghi.

ELISA (Enzime-Linked ImmunoSorbent Assay)

Si tratta di un test immunoenzimatico in grado di rilevare la presenza di un antigene o di un anticorpo la cui peculiarità è quella combinare una reazione immunologica (legame Ag-Ab) con una enzimatica per ottenere una variazione di colore del substrato che può essere rilevata ad occhio nudo o tramite fotometri per avere misura semi-quantitativa. Esistono diverse implementazioni e varianti di questa tecnica ad uso laboratoristico e ambulatoriale: i classici “test rapidi” per FIV e FeLV sono di questo tipo.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Questa tecnica, inventata da Mullis nel 1985 permette di amplificare, creare milioni di copie un segmento di DNA attraverso ripetuti cicli di duplicazione. In estrema sintesi: la doppia elica del DNA viene separata nei due filamenti (denaturazione), ai singoli filamenti si appaiano (annealing) i due primer che individuano gli estremi del frammento da amplificare, infine si fanno “crescere” (elongation) i nuovi filamenti a partire dai primer ottenendo due coppie bicatenarie; il procedimento viene ripetuto indicativamente 30-40 di volte. I primers sono dei piccoli frammenti di una ventina di basi che per il meccanismo di accoppiamento dei nucleotidi (A-T, C-G) si legano in punti precisi dei due filamenti di DNA che individuano inizio e fine del segmento di DNA di interesse (un gene, un provirus, che ovviamente deve essere noto). L’enzima DNA polimerasi necessita di questo “starting point” ed è in grado di aggiungere nucleotidi, rispettando il meccanismo di accoppiamento delle basi solo in una direzione (5’->3’); al primo ciclo, dal DNA iniziale otterremo per denaturazione due filamenti completi e a seguito del processo di annealing ed elongation ci troveremo con due catene ciascuna composta da un filamento completo e l’altro parziale che comprende il segmento di interesse più una “coda”.

Schematizzazione PCR

Solo dal terzo ciclo, come evidenziato in figura, si otterranno delle copie “pulite” del segmento di interesse (ampliconi): iterando questo processo, il numero di copie dei segmenti di interesse costituirà la quasi totalità delle catene di DNA presenti. Tramite elettroforesi e altre tecniche si potrà poi vedere se il segmento di DNA di interesse era presente o meno nel campione.
I processi sommariamente descritti(4) avvengono a temperature diverse (circa 90°C per la denaturazione, 50-65°C per l’annealing e indicativamente 70-80°C per l’elongazione): ciò comporta che i “reagenti”, cioè i nucleotidi che costituiscono i “mattoncini” dei nuovi filamenti sintetizzati e l’enzima DNA polimerasi devono resistere a questi sbalzi di temperatura. Inizialmente, quando si usava la polimerasi derivata dall’E. coli, era necessario aggiungerne di nuova ad ogni ciclo in quanto questo enzima non reggeva la temperatura necessaria alla denaturazione. Successivamente sono state individuate nuove polimerasi termoresistenti (es. Taq polimerasi) estratte da archeabatteri (Thermus acquaticus ed altri) che vivono naturalmente nelle profondità oceaniche a ridosso di sorgenti ad alta temperatura. Attualmente tutto il processo della PCR è automatizzato ed è commercialmente disponibile per moltissime analisi in ambito virologico e microbiologico.
Tra i diversi tipi di PCR disponibili va ricordata la RT-PCR che permette di effettuare questo tipo di analisi su RNA: in questo caso si deve prima ottenere un cDNA tramite il processo di trascrittasi inversa (l’enzima di retrotrascrittasi viene ricavato da diverse specie di virus).

Rilevazione e misurazione degli anticorpi

La rilevazione di anticorpi contro un determinato agente virale è un modo per fare una diagnosi indiretta che pone comunque una serie di problemi quali ad esempio l’interferenza con anticorpi derivati da una immunizzazione passiva (vaccino, anticorpi materni)(5) e la distinzione tra precedente esposizione ed infezione acuta e la classe di immunoglobuline presa in considerazione (6). Il metodo diagnostico classico prevede un doppio prelievo di siero, il primo nella fase acuta e il secondo nella fase di convalescenza (un paio di settimane dopo): qualora si evidenzi un aumento superiore alle 4 volte del titolo si ha una diagnosi “retrospettiva” positiva. La ricerca del titolo anticorpale non è indicata per una diagnosi “precoce” della malattia in quanto la risposta anticorpale si manifesta a distanza di giorni dalla comparsa dei primi sintomi; è però utile a valutare una precedente esposizione, cosa che in molti casi può servire a stabilire se un animale può essere introdotto in sicurezza in un ambiente a rischio o meno.
Esistono metodiche molto diverse per individuare o quantificare la presenza di anticorpi: ad esempio i test rapidi ELISA per FIV (Ab) sono dei test che indicano presenza o assenza dell’anticorpo ma la stessa metodica diversamente implementata può anche essere utilizzata per ricavare un dato semi-quantitativo.
Il titolo anticorpale indica la più bassa concentrazione di siero in cui si rileva una attività contro un antigene. Il siero subisce successive diluizioni (generalmente da 1:16 a 1:4096) e, attraverso diverse tecniche, si verifica se c’è attività contro un antigene nelle successive diluizioni del siero: se ad esempio nella provetta con diluizione 1:128 c’è attività e non c’è in quella successiva (1:256) allora il titolo è 128 (oppure 1:128 come indicano alcuni laboratori).

Altre tecniche che permettono di rilevare o quantificare degli anticorpi sono I test di neutralizzazione, i quali consistono nel contaminare il campione con il virus in esame e valutare se e in che misura gli anticorpi presenti hanno un effetto neutralizzante: particolarmente utile nel caso di nuovi virus per cui non esistono ancora test validati. La tecnica Western Blotting, che invece permette l’individuazione precisa di determinate proteine in piccolissima quantità da un campione eterogeneo (es un lisato cellulare); è un procedimento molto complesso e non viene usato routinariamente nelle indagini virologiche ma è fondamentale nell’individuare le proteine virali immunogeniche. Ancora, nei casi di virus che causano emoagglutinazione (es. virus dell’influenza canina) si può ricorrere al test di inibizione dell’emoagglutinazione: al campione diluito in modo seriale si aggiunge il virus e si determina il titolo osservando fino a che diluizione gli anticorpi presenti sono in grado di bloccare l’agglutinazione.

Fonti principali:

Note di biologia (for dummies)

Parlando di virus non si può prescindere dall'accennare ad alcuni elementi fondamentali di biologia, almeno a quelli di più stretto interesse. Questa parte è stata intitolata come "for dummies" ad evidenziare il suo carattere incompleto, superficiale e mancante di molti elementi.

DNA, nucleotidi, direzionalità (sense/antisense)

DNA ed RNA sono molecole strutturalmente simili costituite da catene di nucleotidi. Ogni singolo nucleotide è costituito da un gruppo fosfato, uno zucchero (deossiribosio nel DNA e ribosio nel RNA) e una base azotata. Il gruppo fosfato e lo zucchero costituiscono il “backbone”, gli elementi portanti della catena del DNA/RNA e si possono pensare come mattoncini del Lego, ciascuno con una protuberanza (gruppo fosfato) ed un incavo (lo zucchero) che si incastrano gli uni con gli altri. Questa catena presenterà quindi ad un estremo una protuberanza e all’altro un incavo: è quello che si chiama “polarità” e viene indicata con i termini 5’ (five prime) end e 3’ (three prime) end. Ad ognuno di questi mattoncini è connessa una base azotata che può essere Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) e Timina (T), nel RNA la Timina è sostituita con Uracile (U). L’insieme, la sequenza di queste basi, costituiscono il contenuto informativo del genoma.
Il DNA è organizzato in una doppia elica che vede all’esterno le catene di gruppi zucchero-fosfato e all’interno le basi legate tra loro in modo più debole. Ogni base si può legare solo con una base ad essa complementare (C con G e T o U con A). Gli estremi delle due catene che formano l’elica saranno una 5’ e l’altra 3’. Questa direzionalità è ovviamente un concetto importante per la lettura delle informazioni (questo testo lo leggete da sinistra a destra e non viceversa…) quanto per il modo di “scriverle” (la DNA polimerasi, l’enzima che permette di costruire un filamento di DNA, opera sempre in direzione 5’->3’).
Supponendo un frammento ACCTGA il suo complementare sarà TGGACT. Questa sequenza di basi è di fatto un codice attraverso il quale si mantengono e si possono trasmettere tutte le informazioni necessarie alla cellula per vivere e riprodursi. Nelle cellule eucariote la complementarietà delle basi fa sì che “aprendo” la doppia elica del DNA (tramite appositi enzimi quali elicasi, topoisomerasi, ecc.) si possano ottenere, a partire dalle singole catene due filamenti identici e complementari. Se facciamo una “copia” delle singole catene avremo due DNA bicatenari identici a quello di partenza: questa è la base dell’ereditarietà.
La complementarietà delle basi (C-G, T/U-A) e la direzionalità (in che direzione leggiamo le informazioni, 3’->5’ o 5’->3’) fanno intuire come “giocando” a sintetizzare (trascrivere) altre catene a partire da un segmento di DNA o RNA possiamo ottenere risultati diversi che mantengono lo stesso contenuto informativo ma possono o meno essere direttamente utilizzabili (ad es. le stringhe “gatto” e “ottag” sono diverse ma se leggo la seconda al contrario ottengo la prima). Il DNA si può pensare come il disco di un computer in cui sono contenute tutte le informazioni organizzate in directory e files (molto grossolanamente paragonabili ai cromosomi ed ai geni), ma come in un computer, tali informazioni devono essere lette ed interpretate per poter essere utilizzate. La lettura e l’utilizzo delle informazioni mantenute nel DNA (l’espressione dei geni) avviene in due passi. Il primo è la trascrizione di un segmento di DNA in una copia complementare di RNA (detto mRNA, messenger RNA). Nel secondo passo si utilizza questo mRNA come template per la successiva traduzione delle informazioni in “istruzioni” per l’assemblaggio delle proteine a partire dagli aminoacidi essenziali (passaggio che avviene nei ribosomi con il concorso di enzimi ed altre forme di RNA).
Le due catene del DNA sono complementari e vengono dette l’una “sense” (la catena 5’->3’) e l’altra “antisense” (la catena 3’->5’); la catena, o meglio il segmento che viene usata per la trascrizione in mRNA è quella antisense che produrrà quindi una sequenza analoga a quella della catena sense (dove le informazioni sono codificate in modo leggibile per la sintesi delle proteine). Quindi un RNA sense, o RNA(+) è un RNA la cui codifica è direttamente utilizzabile mentre un RNA antisense, o RNA(-) no e per essere utilizzabile deve prima convertito in RNA(+).

Quindi...

  • DNA e RNA sono macromolecole che hanno entrambe un contenuto informativo e come tali, con passaggi più o meno complessi, possono guidare un processo che porta alla loro duplicazione e alla sintesi di proteine;
  • Nelle cellule eucariote il DNA è double stranded (o bicatenario) e l’RNA è monocatenario; nei virus possiamo avere DNA a singola e doppia elica;
  • Nelle cellule eucariote il mRNA è monocatenario sense o RNA(+) mentre nei virus l’RNA è mono o bicatenario a polarità (sense) positiva o negativa;
  • Le cellule (eucariote e procariote) dispongono solo degli enzimi necessari alla trascrizione DNA->RNA (e RNA->proteine) è questo è il “dogma centrale” della biologia. In alcune specie di virus si realizza il processo RNA->DNA grazie ad un particolare enzima virale (trascrittasi inversa o retrotrascrittasi).

Fonti principali:

Duplicazione del DNA (polimerasi, frammenti di Okazaki)

Nel processo di duplicazione del DNA i singoli filamenti fungono da template per quelli che vengono sintetizzati. Quindi ogni doppia elica risultante sarà costituita da un filamento “vecchio” e uno di nuova sintesi, ragione per cui il processo viene chiamato semiconservativo. Il processo di duplicazione richiede l’intervento di numerosi enzimi sia per la sintesi delle nuove catene sia per le operazioni “meccaniche” necessarie al processo. I legami, deboli, tra le basi corrispondenti che tengono assieme le due catene devono essere rotti per poter svolgere e rendere accessibili i singoli filamenti: questa apertura/svolgimento della doppia elica avviene ad opera dell’enzima elicasi. Dato un punto di inizio detto fork (nelle cellule eucariote ci sono molti di questi starting point) i due pezzi di filamento liberi vengono inizialmente “protetti” da proteine dette SSB (Single-strand DNA-binding proteins) che, tra l’altro impediscono che si richiudano nuovamente. Nelle operazioni di svolgimento della doppia elica intervengono anche le topoisomerasi, altri enzimi che operano a valle della forcella di replicazione impedendo un eccessivo attorcigliamento della parte ancora chiusa (immaginate di sfilacciare una corda intrecciata e la funzione delle topoisomerasi risulterà evidente). La costruzione vera e propria del nuovo filamento è ad opera di un altro enzima detto DNA polimerasi la cui funzione è solo quella di attaccare nuovi nucleotidi ad altri già esistenti. Quindi, per costruire la nuova catena, non basta la DNA polimerasi ma serve un “primo tassello”, detto primer o innesco, prodotto come un breve RNA grazie ad un enzima detto DNA primasi.
Abbiamo visto che i due filamenti sono di senso opposto: 3’-5’ e 5’-3’. Bene, la DNA polimerasi, oltre ad aver bisogno di un primer ha anche il “limite” di poter aggiungere nucleotidi solo in senso 5’-3’: quindi va tutto bene per la duplicazione di un filamento, ma per l’altro? I due filamenti vengono detti leading strand (5’-3’) e lagging strand (3’-5’) ad indicare che il primo è il filamento guida e il secondo è il filamento “ritardo”. Visto che non è possibile sintetizzare un filamento in direzione 3’-5’, man mano che la doppia elica viene srotolata, sul lagging strand si duplicano tanti piccoli frammenti, sempre in direzione 5’-3’: questi frammenti sono detti frammenti di Okazaki dal nome di Reiji Okazaki che li scoprì nel 1968. Abbiamo quindi una catena che viene duplicata linearmente (leading) e una catena che viene duplicata “a pezzi”: ovviamente la formazione di ogni singolo frammento richiede un primer di innesco dopodiché tutti questi frammenti andranno “ripuliti” dai primers RNA e legati tra loro: questo compito è svolto dell’enzima DNA ligasi. Questo, molto schematicamente e con molte lacune (es. riparazione del DNA) è il meccanismo di duplicazione del DNA.

Fonti principali:

Codoni, ORFs, e sintesi delle proteine

Gli aminoacidi necessari alla sintesi di tutte le proteine sono solo 20 e possono essere codificati con 3 nucleotidi (43=64 combinazioni): la tripletta di tre nucleotidi che identifica un aminoacido è detta "codone". Una sequenza di DNA/RNA codificante per una proteina composta da 10 aminoacidi sarà quindi composta da un codone di start, 10 codoni che rappresentano i singoli aminoacidi e un codone di stop.
Data una sequenza di DNA/RNA che sappiamo va letta in termini di triplette possiamo identificare tre diverse decodifiche teoriche (reading frames) che ci permettono di tradurre una sequenza di nucleotidi in una di aminoacidi: uno a partire dal primo nucleotide, uno dal secondo e un altro dal terzo. Le sequenze che contengono un codone di start (che è sempre un aminoacido, la metionina), un certo numero di codoni che identificano gli aminoacidi componenti e un codone di stop sono dette ORFs (Open Reading Frames). Negli RNA virali gli ORFs possono essere innestati. Da notare che ad ogni aminoacido corrispondono più codifiche (ad esempio l’asparagina può essere codificata come AAT, AAC; l’arginina come CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG, ecc.) per questo il codice genetico è detto “degenere” e serve a minimizzare gli effetti deleteri delle mutazioni in quanto il “peso” di un errore è inferiore in una codifica multipla che non in una singola.
L’mRNA, sintetizzato nel nucleo e contenente le istruzioni per la sintesi delle proteine, migra nel citoplasma dove si incontra con i ribosomi che sono strutture macromolecolari in cui si realizza l’interazione tra mRNA, i singoli aminoacidi e altre due strutture “di collegamento” (tRNA e rRNA). Il tRNA è un piccolo RNA che presenta una sequenza complementare ai codoni del mRNA detta anticodone e una regione che lega uno specifico aminoacido: esistono tanti tRNA diversi per i singoli aminoacidi. Il tRNA interagisce con il rRNA (ribosomal RNA) che è il maggior costituente dei ribosomi ed ha la funzione di sintetizzare il legame tra i diversi aminoacidi. Immaginiamo che il mRNA “scorra” all’interno dei ribosomi dove i singoli codoni vengono riconosciuti in sequenza dai tRNA che a loro volta indicano quali aminoacidi devono essere collegati tra loro e in quale ordine (rRNA e proteine sintetizzano questi legami) fino al raggiungimento del codone di stop.

Fonti principali:

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